細胞培養(yǎng)的具體操作步驟以及注意事項
細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。
不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細胞培養(yǎng)都是一個*的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)?？寺 ＜毎囵B(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié)，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。
細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中重要和常用技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。
一、細胞復蘇
將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。
加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、細胞傳代
細胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。
加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細胞凍存
細胞密度達到80%～90%時，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異bing醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。
凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
注意事項
（1）進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時，必須嚴格按照下列步驟操作：
①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。
?、诖_定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。
③確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時進行補充。
④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。
⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。
⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。
?、邔嶒炌戤吋皶r收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。
（2）細胞污染的預防
?、賹嶒炗闷贩乐刮廴尽＜毎囵B(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*，各種溶液滅菌要仔細，并在無菌實驗檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
?、诓僮鬟^程防止污染。
?、鄞┲菀灼痨o電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進入細胞間。
?、軐嶒為_始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全柜之外的物品，必須及時對手套進行消毒。
⑤進入細胞培養(yǎng)間后關(guān)好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全柜的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大規(guī)模污染。
?、藜毎僮鲿r動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。
⑦實驗操作時生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區(qū)，以免造成不必要的污染。
⑧瓶蓋應當?shù)狗旁谶h離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。
⑨不要從敞開的容器口上方經(jīng)過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。
⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。
?。?）防止細胞交叉污染
①在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，作上標記便于辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發(fā)生t昆亂。
②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細胞。
?、鬯屑毎坏┵徶?，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復蘇細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。
